Analiza e ADN-së së kometës së spermatozoideve. Një metodë për përpunimin dhe analizimin e imazheve të objekteve të ngjashme me kometën, të marra me metodën ADN-kometë. Inkubimi i qelizave me mostra testuese

Metoda e elektroforezës me xhel njëqelizore ose metoda e kometës së ADN-së është shumë e ndjeshme dhe siguron besueshmëri të lartë të rezultateve të fituara, në të njëjtën kohë është relativisht e thjeshtë dhe e shpejtë për t'u kryer, si dhe është e standardizuar ndërkombëtarisht (OECD Nr. 489). Kjo metodë është më premtuese për zgjidhjen e problemeve të mëposhtme:

Biomonitorimi i njerëzve dhe mjedisit, domethënë identifikimi i pasojave të mutagjenezës së induktuar kur një person bie në kontakt me ksenobiotikë (drogë, aditivë ushqimorë, pesticide, parfume dhe kozmetikë, kimikate shtëpiake, si dhe ujin, ajrin dhe industrinë më të zakonshme. rreziqet, nanomaterialet);

Kërkime në fushën e onkologjisë;

Studimet e sistemeve të riparimit të ADN-së;

Metoda bazohet në regjistrimin e lëvizshmërisë së ndryshme në një fushë elektrike konstante të ADN-së së dëmtuar dhe/ose fragmenteve të ADN-së të qelizave individuale të lizuara, të mbyllura në një xhel të hollë agaroze në një rrëshqitje standarde qelqi. Në të njëjtën kohë, ADN-ja e qelizës migron, duke formuar një gjurmë elektroforetike që i ngjan vizualisht një "bishti kometë", parametrat e së cilës varen nga shkalla e dëmtimit të ADN-së. Pas përfundimit të elektroforezës, rrëshqitjet ngjyrosen dhe analizohen duke përdorur mikroskopin fluoreshent.

Marrja e imazhit dhe përpunimi i të dhënave kryhet duke përdorur një kompleks harduer-softuerësh, i cili përfshin një kamerë shumë të ndjeshme të kombinuar me një mikroskop dhe softuer të specializuar.

Softueri inteligjent universal i përfshirë në këtë kompleks ofron:

Analiza e automatizuar e imazheve të kometave të ADN-së "një klik", përfshin të gjithë parametrat bazë të matjes duke përfshirë % ADN në bishtin e kometës;

- riprodhueshmëri e lartë;

Analiza e parametrave të kometave të ADN-së kryhet si në modalitetin "kohë reale" dhe nga imazhet dixhitale të ruajtura;

Programi përpunon të dhënat dhe i shfaq ato në formën e një protokolli në përputhje me kërkesat ndërkombëtare të GLP;

Analiza dhe krahasimi i të dhënave;

Programi është plotësisht i vlefshëm dhe përputhet me kërkesat ndërkombëtare të GLP. Ka akses hierarkik dhe sistem të mbrojtjes së të dhënave.

Kompleti përfshin:

1. Mikroskopi biomjekësor lumineshent Nikon Eclipse Ni-E.

2. Sistem ndriçimi epi-fluoreshent 50W, komplet filtër-pasqyrë-dikroike për ngjyrat DAPI, FITC, TRITC.

3. Kamera monokrome CCD IEEE1394 FireWire për ndriçim. Basler Scout scA1300-32fm. Madhësia e pikselit - 3,75 µm x 3,75 µm. Rezolucioni - 1296 px x 966 px. Madhësia e sensorit 1/3 inç. Matrica - Sony. Transferimi i të dhënave përmes portit me shpejtësi të lartë - 1394 BUS. Shpejtësia e kuadrove në rezolucion maksimal - 32 korniza / sek. Ofron punë me objekte në kohë reale

4. Comet Assay IV - një paketë softuerësh për Windows me një gjenerator të fletëllogaritjes për Microsoft Excel, për të punuar me një videokamerë monokrome CCD IEEE1394 FireWire në kohë reale (matjet dhe analizat janë të mundshme si në një transmetim video ashtu edhe në fotografi), një udhëzim manual dhe një CD për të instaluar dhe vërtetuar programin.

5. Licencë njëvjeçare për katër përdorues.

6. Mësimi në distancë nëpërmjet internetit për katër përdorues.

Ofrohet gjithashtu:

1. Operatori i të dhënave të përdorë Comet Assay IV në versionet XML të bazave të të dhënave për kërkimin, filtrimin dhe nxjerrjen e të dhënave dhe auditimin përmes një baze të dhënash të sigurt Oracle të ruajtur në formatin e fletëllogaritjes MS Excel. Përfshin aftësinë për të parë imazhet e ruajtura automatikisht, nënshkrimet, të dhënat e arkivuara dhe të dhënat e auditimit automatik. Për më tepër përfshin aftësinë për të eksportuar të dhëna të panënshkruara dhe të nënshkruara dixhitale në formatin XML. Përfshin vetëm Crypto-Key-Prove për të parë të dhënat e nënshkruara dixhitale në formate të ndryshme.

2. Qasja e menaxherit në sistemin GLP. Access Manager është një program për të kontrolluar dhe menaxhuar aksesin e punonjësve në bazat e të dhënave. Sistemi i unifikuar për toksikologjinë gjenetike PI. Përfshin një auditim gjithëpërfshirës të sistemit. Auditimi i jashtëm. Administrimi i llogarive të përdoruesve dhe aktiviteteve të përdoruesve në lidhje me programet, aksesin, fjalëkalimet, rishikimet, etj. Përdor Oracle për të mbrojtur në mënyrë të sigurt përdoruesit dhe të dhënat e auditimit. Pajtueshmëria e plotë me rregullat përfundimtare të FDA 21 CFR Pjesa 11 për të dhënat elektronike dhe nënshkrimet elektronike.

3. Trajnimi i përdoruesve të vetëm bazuar në instrumentet Perceptive në MB

Një grup i shumë "vrimave" mikroskopike në sipërfaqen e xhelit, secila prej të cilave përmban qelizën e analizuar.

Nën ndikimin e një fushe elektrike, qelizat e vendosura në xhel fillojnë të lëvizin, duke lënë pas një gjurmë që i ngjan bishtit të një komete. "Bishti" më i ndritshëm dhe më i gjatë i përkasin qelizave me shkallën më të lartë të dëmtimit të ADN-së.

ADN-ja jonë është vazhdimisht nën kërcënim nga rrezatimi, rrezet ultravjollcë, ndotësit në ushqimin tonë dhe mjedisin. Të gjithë këta faktorë mund të dëmtojnë materialin tonë gjenetik, duke çuar në kancer dhe sëmundje të tjera.

Analiza e dëmtimit të ADN-së është thelbësore për të kuptuar natyrën e këtyre sëmundjeve dhe gjetjen e trajtimeve të reja, por aktualisht, metodat për zbulimin e dëmtimit të ADN-së kërkojnë punë të lodhshme dhe që kërkon shumë kohë. Megjithatë, një grup bioinxhinierësh në MIT ka zhvilluar një mënyrë të re për të zbuluar shpejt dëmtimin e ADN-së në një sërë mjedisesh, duke premtuar ta bëjnë një analizë të tillë një metodë të zakonshme në shqyrtimin e drogës dhe studimet epidemiologjike të ekspozimit mjedisor.

Teknika e propozuar bazohet në një test 30-vjeçar të njohur si analiza e kometës. Ky test është quajtur kështu për shkak të formës së kometës së shtupës së formuar nga ADN-ja e dëmtuar. Por ndryshe nga metoda tradicionale, teknologjia e re mund të analizojë një numër shumë më të madh qelizash dhe ta bëjë atë shumë më shpejt.

Teknologjia mund t'u ofrojë epidemiologëve një mënyrë të re për të zbuluar rreziqet mjedisore shumë kohë përpara se të shkaktojnë kancer, mjekët mënyra për të përmirësuar trajtimet e kancerit dhe studiuesit e industrisë farmaceutike mënyra për të zbuluar barna të reja dhe për të identifikuar barnat e rrezikshme.

"Karakteristika më e rëndësishme e teknologjisë sonë është se ajo mund të përdoret për të zbuluar substanca gjenotoksike (shkaktuese mutant) në mjedis duke përdorur pajisjet më themelore të kërkimit," thotë Bevin Engelward, asistent profesor i bioinxhinierisë dhe një nga bashkautorët e puna.

Artikull për konkursin "bio/mol/tekst": A e dini se kometat studiohen jo vetëm nga astronomët, por edhe nga biologët molekularë? Puna e tyre është e lidhur me hapësirën vetëm në mënyrë indirekte. Ata shikojnë kometat përmes një mikroskopi. Shërben si një qiell me yje rrëshqitje xhel- rrëshqitje qelqi mikroskopike e veshur me agarozë me qelizat në studim. Kjo u bë e mundur nga zbulimi në vitin 1984 i një metode të analizës së ADN-së të quajtur metoda e kometës së ADN-së.

Rreth popullaritetit në numra

Figura 2. Shembuj të dëmtimit të ADN-së që rezulton nga veprimi i faktorëve të natyrës së ndryshme

Siç mund ta shihni, "grabitësit" mund të kryejnë një sërë "krimesh" dhe të shkaktojnë dëme të konsiderueshme në integritetin e ADN-së. Sidoqoftë, në qelizë, siguria e ADN-së ruhet nga sistemet e riparimit, "shëruesit" që korrigjojnë dëmtimin e molekulës me ndihmën e "ilaçeve" speciale - enzimave që mund të "shtojnë plagët" të shkaktuara nga gjenotoksikantë. Ka shumë enzima riparuese. Aktualisht dihet se riparimi i ekscizionit Dëmtimi i ADN-së, d.m.th. në operacione, kur vendi fillimisht pritet dhe më pas rimontohet, marrin pjesë 13 enzima!

Sidoqoftë, jo gjithçka është aq e qetë sa duket në shikim të parë. Operacionet në "repartin e riparimit" nuk përfundojnë gjithmonë me sukses, d.m.th. restaurimi i molekulës origjinale të ADN-së. Rezultati i punës së sistemeve të rikuperimit mund të jetë dëmtim i ri. Arsyeja për këtë është paketimi shumë i dendur i vargjeve të ADN-së në bërthamë.

Por çfarë ndodh me shkencëtarët? Ata veprojnë si “policë” që duhet të identifikojnë “përbërësit e krimit”, d.m.th. gjeni "kriminelin" dhe "bashkëpunëtorët" e tij (përcaktoni gjenotoksikanët, dozat dhe përqendrimet e tyre) dhe përcaktoni ashpërsinë e "krimit" (identifikoni shkallën e dëmtimit të ADN-së). Pikërisht në situata të tilla ndihmon metoda e kometës së ADN-së.

Me origjinë nga Suedia

Përpjekjet që synonin studimin e strukturave bërthamore të qelizës dhe përcaktimin sasior të dëmtimit të vargut të ADN-së në qelizat e vetme të organizmave u bënë që në vitet 1980. Shekulli XX nga shkencëtarë të tillë si Cook dhe Brazell, Rydberg dhe Johanson. Megjithatë, vetëm në vitin 1984 studiuesit suedezë Ostling dhe Johanson zhvilluan një metodë të re për zbulimin e dëmtimit të ADN-së. Ishin ata që vunë re se imazhet e fragmenteve të ADN-së që migronin në një fushë elektrike u ngjanin kometave astronomike. Kishte një ngjashmëri. "Kometat" e marra nga shkencëtarët nga Suedia kishin karakteristikat kryesore të "vëllezërve" hapësinor: ata kishin një "kokë" dhe një "bisht". Nga këtu erdhi një emër kaq romantik - metoda e kometës së ADN-së.

Metoda ka një numër emrash të tjerë - elektroforeza me xhel të qelizave të vetme (të izoluara). Dhe elektroforezë në mikroxhel . Emri i parë pasqyron gabimisht thelbin e analizës. Elektroforeza nuk kryhet në qeliza të vetme, por në një xhel agarozë, ku ADN-ja e izoluar nga të njëjtat qeliza lëviz nga një pol në tjetrin. E dyta është e saktë, sepse elektroforeza kryhet në xhel agarozë të aplikuar në rrëshqitje. Por ky term nuk e kapi. Këta emra nuk janë shumë të njohur dhe përdoren rrallë, në ndryshim nga "metoda e kometës së ADN".

Drejtshkrim për të marrë "kometa"

Figura 3. Struktura e "kometës".

"Kometat" laboratorike janë objekte interesante. Pamja e tyre varet drejtpërdrejt nga faktorët e ndikimit, forca e tyre dhe kushtet e analizës. Informacioni për "kometat" nuk është sekret, i mbështjellë në errësirë, kështu që dihet pothuajse gjithçka për përbërjen, strukturën dhe formimin e tyre.

Në një botim të vitit 1984, suedezët Ostling dhe Johanson e quajtën ADN-në që migroi "bisht" dhe ADN-në e mbetur në zgavër "qendër". Tani, praktikisht asgjë nuk ka ndryshuar: "kometa" dallohet në mënyrë konvencionale nga "koka" dhe "bishti" (Fig. 3).

Duhet të kuptohet qartë se një "kometë" nuk formohet nga një qelizë e një organizmi të gjallë, por nga ADN-ja e tij. të ngulitura në një shtresë agaroze pezullimi i qelizave formon zgavra, të cilat në proces liza zë ADN-në e këtyre qelizave. Të gjitha manipulimet e mëtejshme në metodën e kometës së ADN-së kryhen me ADN.

"Kometat" formohen në procesin e migrimit (lëvizjes) të ADN-së në një fushë elektrike (kur ka rrymë dhe tension). Çfarë ndodh gjatë liza Dhe elektroforeza? Biomolekulat më të vogla që përbëjnë qelizën “shpëtojnë” në tretësirën e lizës gjatë difuzionit, në ndryshim nga ADN-ja, e cila, për shkak të madhësisë së saj jashtëzakonisht të madhe, nuk mund të lëvizë. Kur rrëshqitjet me ADN i nënshtrohen elektroforezës, ADN-ja e paprekur formon një "kokë kometë" dhe pjesët e dëmtuara të molekulave fillojnë të "lundrojnë" drejt një burimi aktual të ngarkuar pozitivisht - anoda (sepse ADN-ja është e ngarkuar negativisht), duke formuar një "bisht". “. Për të parë "kometat" që rezultojnë, ato ngjyrosen me ngjyra fluoreshente (etidium bromid, akridine portokalli, etj.), dhe më pas vizualizohen duke përdorur një mikroskop fluoreshent me zmadhim të lartë (Fig. 4).

Ostling dhe Johanson shkruajnë sa vijon: “Kur një qelizë futet në një xhel, ajo formon një depresion në të. Pas lizës së qelizave, ADN-ja e saj zë këtë depresion. Shumica e biomolekulave të tjera shpërndahen lehtësisht përmes xhelit të agarozës. Kështu, pothuajse të gjithë dalin nga zgavra e lënë nga qeliza në tretësirën lizuese. Përjashtimi i vetëm është ADN-ja, e cila, për shkak të peshës së saj të madhe molekulare, mbetet në xhel. - Ed.

Figura 4. Sekuenca e hapave të metodës së kometës së ADN-së(duke filluar në drejtim të akrepave të orës nga lart). * - Hapi nevojitet vetëm në versionin alkalik të metodës (pH > 13.0) për të neutralizuar alkalin me NaOH.

Sa më i fortë të jetë dëmtimi i ADN-së (dhe shkalla e dëmtimit varet nga doza e mutagjenit), aq më i theksuar është "bishti i kometës". Siç e keni kuptuar tashmë, një "bisht" i gjatë nuk është shumë i mirë.

Ushtar Universal

Metoda e kometës së ADN-së është një mjet me gamë të gjerë. Me ndihmën e tij, shkencëtarët "zgjidhin krimet" që lidhen me një përpjekje për shëndetin e njeriut dhe sigurinë mjedisore (natyrisht, e gjithë kjo përmes studimit të ADN-së së dëmtuar). Metoda ka fituar një popullaritet të tillë për shkak të karakteristikave të saj tërheqëse - thjeshtësisë, shpejtësisë, ekonomisë dhe ndjeshmërisë mjaft të lartë, gjë që bën të mundur zbulimin e dëmtimit të ADN-së të shkaktuar edhe nga faktorë me intensitet të ulët (për shembull, doza të ulëta të rrezatimit). Ndër metodat e shumta për vlerësimin e dëmtimit të ADN-së, metoda e kometës së ADN-së është një nga më të përshtatshmet në këtë fushë. Përveç avantazheve të mësipërme, ai tejkalon, për shembull, të njohurit metodat citogjenetike (ana-telofazike, analizat e metafazës, testi i mikronukleusit), dhe për arsye të tjera të mira.

Metoda e kometës së ADN-së ju lejon të punoni me çdo qelizë që përmban ADN, në ndryshim nga testi i mikronukleusit, i cili më së shpeshti përfshin qelizat e gjakut ose të palcës kockore. Nëse metodat ana-telofazë dhe metafazë janë të kufizuara në listën e përcaktuar aberacionet kromozomale, më pas metoda e kometës së ADN-së ofron një gamë të gjerë modifikimesh të saj, falë të cilave studiuesi mund të zbulojë një sërë dëmtimesh të ADN-së: dëmtime të vetme, të dyfishta, zona të paqëndrueshme alkaline, apoptoza dhe të tjerët. Janë këto mundësi që e bëjnë atë një "ushtar universal" dhe i hapin rrugën metodës në fusha të ndryshme të kërkimit shkencor:

• monitorimi i mjedisit- vlerësimi i gjendjes së mjedisit sipas shkallës së dëmtimit të ADN-së së organizmave që jetojnë në zonën e studimit (si rregull krahasohen nivelet e dëmtimit të ADN-së të individëve nga zonat e kontaminuara dhe ato të kontrollit);
• monitorimi biologjik- studimi i ndikimit të të ushqyerit dhe faktorëve të tjerë të mjedisit të jashtëm në organizëm për sa i përket shkallës së dëmtimit të ADN-së, akumulimit të dëmtimit dhe riparimit;
• studimet gjenotoksike preparate farmakologjike, kimikate të reja dhe ekzistuese (kimikate shtëpiake, pesticide, etj.);
• hulumtimet klinike që synon diagnozën prenatale në fazën e zhvillimit intrauterin, duke identifikuar predispozicion ndaj sëmundjeve;
• shenjë e efikasitetit Terapia e kancerit dhe kontrolli i tij.

Ndryshimi mësohet nga krahasimi

Vëzhgimi i gjendjes së mjedisit, i ashtuquajturi. monitorimi i mjedisit, i ndihmon studiuesit të identifikojnë ndryshimet në mjedis dhe të japin alarmin në kohë (veçanërisht në situata emergjente, për shembull, në termocentralin bërthamor të Çernobilit në 1986 ose në termocentralin bërthamor Fukushima Daiichi në 2011). Kur mjedisi është i ndotur, metoda e ADN-kometës në kombinim me organizmat tregues vjen në ndihmë. Listat e organizmave karakteristikë të habitateve të ndryshme dhe më të ndjeshme ndaj ndryshimeve në gjendjen e mjedisit janë mjaft të gjera dhe përfshijnë specie duke filluar nga bakteret. Escherichia coli dhe algat e gjinisë Klamidomonas dhe duke përfunduar me bimë më të larta ( Lemna minor, Pinus sylvestris), gjitarët ( Microtus oeconomus) dhe, sigurisht, një person (Fig. 5). Në metodën e kometës së ADN-së, si rregull, nuk përfshihen organizma të tërë, por "pjesët përbërëse" të tyre - qeliza që janë veçanërisht të ndjeshme ndaj ndryshimeve në faktorët mjedisorë, ose indet nga të cilat mund të merren këto qeliza. Qelizat e gjakut zakonisht merren nga kafshët: eritrocitet Dhe limfocitet, hemocite(analoge të eritrociteve te jovertebrorët), celomocitet(qelizat që kryejnë një funksion imunitar te krimbat e tokës); në bimë - qelizat e meristemit, indet që ndajnë intensivisht.

Shënim: Në analizën e dëmtimit të ADN-së, individë të tërë mund të përdoren gjithashtu nëse përfaqësohen nga një qelizë e vetme, si p.sh. Chlorella vulgaris.

Figura 5. Shembuj të organizmave tregues të përdorur për të vlerësuar gjendjen e mjedisit duke përdorur metodën e kometës së ADN-së.

faqet scuola-cucina.com, photosflowery.ru, 4pics.ru, kharkov-fish.ru.gg, 10-themes.com, worldartsme.com, sms.si.edu, wulovef.com, qygjxz.com, hdimagegallery.net , nhm.ac.uk, picstopin.com, functionalecology.org, akva-world.ru, moskvapark.naidich.ru, botany.natur.cuni.cz, rusrep.ru, animalsfoto.com, go-that.appspot.com hdimagelib.com

Si funksionon metoda e kometës së ADN-së në këtë rast? Shkencëtarët krahasojnë shkallën e dëmtimit të ADN-së së organizmave tregues që jetojnë në territoret e studiuara (të kontaminuara) dhe të kontrollit (jo të kontaminuara): të ekspozuar ndaj tokës, ujit të kontaminuar, etj., dhe të njëjta, por që jetojnë në kushte normale kontrolli, d.m.th. kur nuk ka ndikim të faktorit të studiuar ose është i parëndësishëm. Vlerësimi i shkallës së dëmtimit të ADN-së kryhet edhe në laboratorë, në kushte rreptësisht të kontrolluara, kur ekziston një kampion organizmash të ekspozuar ndaj faktorit ose grupit të faktorëve të studiuar (rrezatimi, metalet, pesticidet) dhe domosdoshmërisht një grup kontrolli ( duke mos e përjetuar këtë efekt).

Shembull: Më 11 mars 2011, si pasojë e tërmetit më të fortë në Japoni dhe cunamit pasues, një aksident i rëndë rrezatimi ndodhi në termocentralin bërthamor Fukushima Daiichi. Në vitin 2014, shkencëtarët japonezë kryen një studim. Ata zgjodhën dy vende të prekura nga aksidenti, një me nivel të lartë rrezatimi (2,85 µSv/h) dhe një me nivel të ulët (0,28 µSv/h), si kontrolle. Në krimbat e tokës të familjes Megascolecidae nga këto vende u analizua shkalla e dëmtimit të ADN-së. Rezultoi se ky tregues është dukshëm më i lartë tek individët e ekspozuar ndaj niveleve të larta të rrezatimit sesa tek individët e zonës me nivel të ulët ekspozimi.

Skenarët mund të ndryshojnë. Shkalla e dëmtimit të ADN-së në qeliza mund të rritet, ulet ose mbetet e pandryshuar. Një shkallë e rritur e dëmtimit të ADN-së në organizmat nga një zonë e kontaminuar mund të tregojë ndryshime të brendshme në funksionimin e qelizave, të cilat çojnë në "prishje" të shumta të ADN-së.

Shembuj: Disa metale, duke hyrë në trup, nxisin specie reaktive të oksigjenit (ROS), duke shkaktuar dëmtim të ADN-së; Rrezatimi jonizues kontribuon në formimin e radikaleve të lira, të cilët janë gjithashtu "shkelës" të ADN-së. Veprimi i rrezeve ultravjollcë mund të çojë në formim dimerët në ADN, duke thyer lidhjen e dy zinxhirëve të saj dhe duke ndryshuar kështu konformacionin e molekulës.

Dëmtimi i reduktuar i ADN-së ose asnjë ndryshim sugjeron që organizmat janë përballur me "shtypjen" gjenotoksikantë dhe përshtatur për jetën në këto kushte të pafavorshme. Ky përshtatje quhet përshtatje. Por kjo është një histori krejtësisht tjetër.

Trashëgimia është një forcë e tmerrshme

A keni dëgjuar për sëmundje të tilla si sindroma e thyerjes së kromozomeve (sindroma e dëmtimit të Nijmegen), xeroderma pigmentosa dhe trikotiodistrofia? Ato shfaqen vetëm kur të dy prindërit janë bartës të gjenit të dëmtuar (Fig. 6).

Në literaturë ka të dhëna për mundësinë e përdorimit të metodës së kometës së ADN-së në diagnostikimin e këtyre sëmundjeve trashëgimore, e cila është veçanërisht e rëndësishme në fazën prenatale, d.m.th. gjatë shtatzënisë.

Sindroma e lëndimit Nijmegen (Sindroma e thyerjes Nijmegen, NBS) është një sëmundje e shoqëruar me shkelje të përhershme të integritetit të ADN-së. Problemi është se gjeni NBS1 ndodh një mutacion që "fiket" nibrin- një proteinë që kontrollon riparimin e prishjeve të çiftuara të ADN-së të shkaktuara nga rrezatimi. Kjo është arsyeja pse njerëzit që vuajnë nga kjo sindromë janë jashtëzakonisht të ndjeshëm ndaj radios. Bozena Novotna nga Instituti i Mjekësisë Eksperimentale në Pragë në studimin e saj argumenton se metoda e kometës së ADN-së është e shkëlqyer në identifikimin e bartësve heterozigotë të gjenit. NBS1 nga një nivel anormalisht i lartë i dëmtimit të vargjeve të ADN-së në "kometat" e limfociteve.

Jo më pak të rrezikshme janë xeroderma pigmentoze Dhe trikotiodistrofia. Këto janë sëmundje të rënda njerëzore që janë të trashëguara. Në rastin e parë, me një ekspozim të shkurtër në diell tek fëmijët në zona të hapura të lëkurës (duart, qafë, fytyrë), fillimisht shfaqen njolla të kuqe, të cilat më pas kthehen në pigmentim të theksuar deri në formimin e tumoreve. Sëmundja e dytë shprehet në flokë dhe thonjtë e brishtë, prapambetje mendore dhe anomali në strukturën e kafkës.

Këto sëmundje bashkohen nga një shkelje në punën e riparimit të heqjes së nukleotideve. Bazuar në suksesin e riparimit të heqjes së nukleotideve në qelizat fetale duke përdorur metodën e kometës së ADN-së, është e mundur të përcaktohet nëse fëmija do të vuajë nga këto sëmundje. Rastet e një diagnoze të tillë janë përshkruar në literaturë.

Studiuesit u përballën me detyrën për të gjetur para lindjes nëse fëmijët do të vuanin nga xeroderma pigmentosa dhe trikotiodistrofia. Eksperimentet u kryen në familje në të cilat prindërit janë bartës të gjeneve xeroderma pigmentosum ( X familje) dhe trikotiodistrofia ( Y familje) dhe tashmë keni fëmijë me këto sëmundje .

Familja X: shtatzënia 15 javë, nëna është bartëse e gjenit xeroderma pigmentosa, ka një fëmijë 3 vjeç me këtë sëmundje.

Familja Y: shtatzënia 10 javë, babai dhe nëna - bartës të gjenit të trikotiodistrofisë, dy fëmijë me trikotiodistrofi vdiqën në moshën 22 muajsh dhe 6 vjeç, një më shumë - si rezultat i abortit spontan (abort).

Të gjitha qelizat u ekspozuan ndaj rrezatimit ultravjollcë për 45 minuta.

X Studim Familjar: Niveli i dëmtimit të ADN-së në qelizat fetale, i përcaktuar duke përdorur metodën e kometës së ADN-së, ishte afër nivelit të dëmtimit të ADN-së në fibroblastet e nënës bartëse, d.m.th. korrespondonte me nivelin e dëmtimit të vargut në kushte normale të riparimit të heqjes së ADN-së. Përfundim - fetusi është i shëndetshëm. Ky përfundim u konfirmua pas lindjes së një fëmije normal.

Studimi i familjes Y: në qelizat e fetusit, krahasuar me fibroblastet e babait dhe nënës, u zbulua një defekt në punën e riparimit ekscizional, i cili u konfirmua edhe nga një metodë tjetër që nuk bazohet në studimin e riparimit. Është zbuluar se fetusi është i sëmurë. Pas bisedës me familjen, u vendos që të abortohej.

Industria është armiku i shëndetit të njeriut

Shëndeti i njerëzve që punojnë në objekte industriale ose që jetojnë në zona jo miqësore me mjedisin është në rrezik çdo ditë. Rreziku qëndron jo vetëm në kontaktin e ngushtë të përditshëm të trupit me gjenotoksikantë (rrezatimet jonizuese, metalet e rënda dhe kimikatet e tjera), por edhe në gjasat e situatave emergjente (shih shembujt e mësipërm), pasojat e të cilave mund të jenë katastrofike për organizmat. Ndryshimet në gjendjen e trupit mund të jenë shumë të ndryshme, nga sëmundje të lehta si dhimbja e kokës deri te kanceri.

Metoda e kometës së ADN-së mund të përdoret si një mjet premtues vlerësimi fillestar gjendja e gjenomit të njerëzve që punojnë ose jetojnë në kushte të pafavorshme mjedisore. Kjo do të thotë që kometat e ADN-së mund të përdoren jo vetëm në këto fusha kërkimi, por edhe në fusha të tjera në të ardhmen, të zgjerojnë opsionet për përdorimin e metodës në kërkimin klinik, mjekësi dhe shumë më tepër.

Shembuj: Në Poloni, një aksident në një fabrikë baterish i ekspozoi punëtorët ndaj niveleve të larta të plumbit dhe kadmiumit, gjë që rezultoi në një rritje të vogël por të konsiderueshme të dëmtimit të ADN-së në krahasim me një grup njerëzish që nuk përjetuan një stres të tillë. Efekti gjenotoksik i aerosoleve të saldimit me gaz që përmbajnë metale të rënda - mangan, krom, nikel, kadmium, kobalt, plumb, molibden, hekur - në ADN-në e leukociteve u zbulua për njerëzit, puna e të cilëve ka qenë e lidhur me saldimin për një kohë të gjatë.

Ka disa vështirësi

Për të përdorur saktë metodën e kometës së ADN-së, duhet të "njohni me shikim" jo vetëm aftësitë dhe avantazhet e saj ndaj metodave të tjera, por, natyrisht, edhe disavantazhet, kufizimet dhe vështirësitë që duhet të jeni në vëzhgim. Metoda kërkon optimizimi liza, elektroforeza dhe kushte të tjera në varësi të llojit të qelizave që përdor shkencëtari dhe qëllimeve të studimit.

Shpjegim: Qelizat bimore dhe shtazore kërkojnë kushte të ndryshme për çlirimin e ADN-së, d.m.th. liza. Për shkak të pranisë së një muri qelizor celuloz, qelizave bimore u duhet më shumë kohë për t'u lizuar sesa qelizat shtazore.

Nga vështirësia e parë pason shqetësimi i dytë: përshtatja e metodës me problemet e analizës mund të jetë shumë e vështirë. proces i mundimshëm(megjithëse vetë teknika është e thjeshtë dhe e kuptueshme), veçanërisht nëse askush nuk ka punuar me objektin e studimit tuaj duke përdorur metodën e kometës së ADN-së. Ndodh që "akordimi" i metodologjisë në këtë rast kërkon shumë kohë.

Ndonjëherë ka vështirësi në interpretim rezultatet e marra nga shkalla e dëmtimit të ADN-së, pasi shkalla e dëmtimit nuk mund të lidhet gjithmonë me dozën e faktorit ndikues.

Shpjegim: Një problem i tillë mund të shoqërohet me optimizim të pamjaftueshëm të metodës, kur disa lloje dëmtimesh përzihen me të tjera dhe në këtë mënyrë shtrembërojnë rezultatet. Sistemet e riparimit, të cilat korrigjojnë një pjesë të shkeljeve që rezultojnë, gjithashtu mund të "shqetësojnë" shkallën aktuale të dëmtimit të ADN-së.

Një nga vështirësitë më të mëdha mund të jetë krahasimi i rezultateve të marra duke përdorur metodën e kometës së ADN-së nga shkencëtarë të ndryshëm në laboratorë dhe institute të ndryshme kërkimore. Për të vlerësuar dëmtimin e ADN-së, përdoren metoda me modifikime dhe tregues krejtësisht të ndryshëm (për shembull, përqindja e ADN-së në "bishtin e kometës" ose gjatësia e "bishtit").

Shpjegim: Gjatësia e "bishtit të kometës" është distanca që ADN-ja migroi nga "koka" e bishtit. Përqindja e ADN-së në bishtin e kometës është sasia e ADN-së që migroi në bisht, e shprehur si përqindje. Një listë e plotë e rezultateve të dëmtimit të ADN-së mund të gjendet në www.cometassayindia.org.

Po bëhen përpjekje për të standardizuar përdorimin e metodës së kometës së ADN-së, e cila do t'i ndihmojë shkencëtarët të krahasojnë rezultatet. Për shembull, protokollet dhe udhëzimet janë zhvilluar në studimet gjenotoksike.

Shpjegim: Udhëzimet e Qendrës Federale për Higjienën dhe Epidemiologjinë e Rospotrebnadzor përcaktojnë qartë objektet e provës (qelizat njerëzore) dhe përshkruajnë në detaje të gjitha fazat e analizës. Sipas këtyre rekomandimeve, duke përdorur metodën e kometës së ADN-së, kimikatet shtëpiake dhe produktet e bëra nga materiale polimer mund të testohen për gjenotoksicitet.

konkluzioni

“Ai që është i armatosur është i mbrojtur” – kjo është motoja e punës me metodën e kometës së ADN-së. Njohja e avantazheve dhe vështirësive të përdorimit të kësaj metode për vlerësimin e dëmtimit të ADN-së ju lejon të manipuloni me mjeshtëri rrjedhën e punës, të shmangni "grackat" dhe të merrni rezultate të sakta.

Metoda e kometës së ADN-së luan rolin e një "shkopi magjik" në vlerësimin e gjendjes së përgjithshme të trupit, si rregull, në fazat e hershme të ekspozimit ndaj faktorëve të pafavorshëm mjedisor. Në fazën fillestare, është dëmtimi i ADN-së ai që është përgjigja më e shpejtë dhe për rrjedhojë e vetmja e matshme e trupit ndaj efekteve negative shumë kohë përpara shfaqjes së ndryshimeve në nivel fiziologjik.

Tani e dini se si biologët marrin "kometa" në laboratorë dhe pse u duhen kaq shumë.

Letërsia

1. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.-G. (2009). Analiza e kometës: Një metodë e ndjeshme për zbulimin e dëmtimit të ADN-së në qelizat individuale. metodat. 48 , 46–53;
2. Inge-Vechtomov S.G. Gjenetika me bazat e përzgjedhjes: një libër shkollor për studentët e institucioneve të arsimit të lartë (botimi i 3-të, i rishikuar dhe i plotësuar). Shën Petersburg: N-L, 2015. - 720 f.;
3. Piperakis S.M. (2009). Analiza e kometës: një histori e shkurtër. Biol qelizore. Toksikol. 25 , 1–3;
4. Yarmonenko S.P. Radiobiologjia e njeriut dhe e kafshëve. M.: Më e lartë. shkollë, 2004. - 549 f.;
5. Gatuaj P.R. dhe Brazell I.A. (1976). Karakterizimi i strukturave bërthamore që përmbajnë ADN superhelike. J. Cell Sci. 22 , 303–324;
6. Rydberg B. dhe Johanson K.J. Vlerësimi i thyerjeve të një fije floku në qelizat e vetme të gjitarëve. Në: Mekanizmat e riparimit të ADN-së / ed. nga Hanawalt P.C, Friedberg E.C, Fox C.F. NY: Academic, 1978. fq. 465–468;
7. Ostling O. dhe Johanson K.J. (1984). Studimi mikroelektroforetik i dëmtimeve të ADN-së të shkaktuara nga rrezatimi në qelizat individuale të gjitarëve. Biokimik. Biofiza. Res. komune. 123 , 291–298;
8. Cotelle S. dhe Ferard J.F. (1999). Analiza e kometës në ekotoksikologjinë gjenetike: një përmbledhje. Mjedisi. Mol. Mutagjen. 34 , 246–255;
9. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H. et al. (2000). Analiza e xhelit/kometës me një qelizë të vetme: udhëzime për in vitro dhe in vivo testimi i toksikologjisë gjenetike. Mjedisi. Mol. Mutagjen. 35 , 206–221;
10. Filippov E.V. (2014). Përdorimi i metodës së "kometës së ADN-së" për zbulimin dhe vlerësimin e shkallës së dëmtimit të ADN-së së qelizave të organizmave bimorë, shtazorë dhe njerëzorë të shkaktuar nga faktorët mjedisorë (rishikim). Shkenca dhe arsimi. 2 , 72–78;
11. Collins A.R. (2004). Analiza e kometës për dëmtimin dhe riparimin e ADN-së: parimet, aplikimet dhe kufizimet. Mol. Bioteknol. 26 , 249–261;
12. Fujita Y., Yoshihara Y., Sato I., Sato S. (2014). Radioaktiviteti mjedisor dëmton ADN-në e krimbave të tokës të Prefekturës Fukushima, Japoni. euro. J. Wildl. Res. 60 , 145–148;
13. Barillet S., Buet A., Adam C., Devaux A. (2005). A shkakton ekspozimi ndaj uraniumit gjenotoksicitet në teleostean Danio rerio? Rezultatet e para eksperimentale. Mbrojtja nga radio. 40 , 175–181;
14. Kagan M.Yu., Shulakova N.S., Tumirova R.A., Zlodeeva E.A., Reznik N.V. (2012). Sindroma Nijmegen (vëzhgimi klinik). Farmakologjia pediatrike. 3 , 102–105;
15. Alapetite C., Benoit A., Moustacchi E., Sarasin A. (1997). Analiza e kometës si një test riparimi për diagnozën prenatale të Xeroderma pigmentosum dhe trikotiodistrofisë. J. Invest. Dermatoli. 108 , 154–159;
16. Palus J., Rydzynski K., Dziubaltowska E., Wyszynska K., Natarajan A.T., Nilsson R. (2003). Efektet gjenotoksike të ekspozimit profesional ndaj plumbit dhe kadmiumit. Mutat. Res. 540 , 19–28;
17. Tomilin N.V., Petrov A.N., Filko O.A., Khrabrova A.V., Solovieva N.E., Ivanova T.M. et al (2015). Vlerësimi i shkallës së dëmtimit të ADN-së bërthamore në qelizat e gjakut periferik të njerëzve të lidhur profesionalisht me veprimin e metaleve të rënda. Organizata shëndetësore. 16 , 383–392;
18. Vlerësimi i vetive gjenotoksike me metodën e kometës së ADN-së in vitro: Udhëzime . M.: Qendra Federale për Higjienën dhe Epidemiologjinë e Rospotrebnadzor, 2010.- 16 f.

Parametrat e fragmentimit të ADN-së u studiuan me metodën e kometave të ADN-së në modifikimin alkalik në kushte të niveleve të ndryshme të ekspozimit ndaj faktorit të rrezatimit në kushte shtëpiake. Aktiviteti vëllimor (VA) i radonit, shkalla e dozës ekuivalente të ambientit (AEDR) e rrezatimit gama dhe dendësia e fluksit të rrezatimit beta janë marrë parasysh. Vlera mesatare e RA të radonit në ajrin e brendshëm ishte 89.4 Bq/m3, vlera e ADER të sfondit gama ishte 0.12 µSv/h, dendësia e fluksit të rrezatimit beta ishte 0.6 s-1. Niveli mesatar i fragmentimit të ADN-së ishte 3,48%. Niveli i fragmentimit të ADN-së në 3 parametra (proporcioni i ADN-së në bishtin e kometës, gjatësia e bishtit të kometës, momenti i bishtit të kometës) u rrit te meshkujt, por kjo tendencë nuk arriti domethënie statistikore. Parametrat e kometave të ADN-së nuk ndryshonin ndjeshëm në varësi të ndryshimit të nivelit të radonit. U gjet një korrelacion pozitiv midis performancës së kometave të ADN-së dhe rritjes së fuqisë së rrezatimit gama. Në të njëjtën kohë, ADER i rrezatimit gama ishte brenda kufijve të lejuar në të gjitha ambientet e ekzaminuara.

rrezatimi jonizues

kometat e ADN-së

modifikimi alkalik i kometave të ADN-së

efektet e rrezatimit me dozë të ulët

1. Robertson A., Allen J., Laney R., Curnow A. Efektet kancerogjene qelizore dhe molekulare të ekspozimit të radonit: një përmbledhje // Int. J. Mol. Sc., 2013, vëll. 14, nr. 7, fq. 14024-14063.

2. Druzhinin V.G., Sinitsky M.Y., Larionov A.V. et al. Vlerësimi i nivelit të aberracioneve të kromozomeve në limfocitet e gjakut periferik në fëmijët rezidentë afatgjatë në kushte të ekspozimit të lartë ndaj radonit dhe produkteve të tij të kalbjes // Mutagenesis, 2015, vëll. 30, fq. 677–683.

3. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. Një teknikë e thjeshtë për përcaktimin sasior të niveleve të ulëta të dëmtimit të ADN-së në qelizat individuale // Exp. Cell Res., 1988, vëll. 175, fq. 184–191.

4. Azqueta A., Gutzkow K.B., Brunborg G., Collins A.R. Drejt një analize më të besueshme të kometës: optimizimi i përqendrimit të agarozës, koha e shthurjes dhe kushtet e elektroforezës // Mutat. Res., 2011, vëll. 724, nr. 1–2, f. 41-45.

5. Konca K., Lankoff A., Banasik A. etj. Një program i analizës së imazhit të PC-së në domenin publik ndër-platformë për analizën e kometës // Hulumtimi i Mutacionit, 2003, vëll. 534, fq. 15-20.

6 Glantz S.A. Abetare e Biostatistikës / S.A. Glantz. – McGraw-Hill Medical, botimi 7, 2011. – 320 f.

7. Georgakilas A.G., O'Neill P., Stewart R.D. Induksioni dhe riparimi i lezioneve të grumbulluara të ADN-së: çfarë dimë deri tani? // Rrezatimi. Res., 2013, vëll. 180, fq. 100–109.

8. Kaur S., Sangeeta, Galhna K.K., Gautam N. Vlerësimi i dëmtimit të ADN-së të shkaktuar nga rrezatimi në limfocitet e gjakut periferik të njeriut duke përdorur analizën COMET // Int. J. Life Sci. Scientifi. Res., 2017, vëll. 3, nr. 4, fq. 1208-1214.

9. Miklos M., Gajski G., Garaj-Vrhovac V. Përdorimi i analizës standarde dhe të modifikuar të kometës në vlerësimin e dëmtimit të ADN-së në limfocitet e njeriut pas ekspozimit ndaj rrezatimit jonizues // Radiologjia dhe Onkologjia, 2009, vëll. 43, nr. 2, fq. 97-107.

10. Batar B., Guven M., Baris S. etj. Polimorfizmat e gjenit të riparimit të ADN-së XPD dhe XRCC1 dhe rreziku i leuçemisë limfoblastike akute në fëmijëri // Leuk. Res., 2009, vëll. 33.pp. 759–763.

11. Jiang J., Zhang X., Yang H., Wang W. Polimorfizmat e gjeneve të riparimit të ADN-së: ADPRT, XRCC1 dhe XPD dhe rreziku i kancerit në epidemiologjinë gjenetike // Meth. Mol. Biol., 2009, vëll. 471.pp. 305–333.

12. Larionov A.V., Sinitsky M.Yu., Druzhinin V.G. et al. Riparimi i heqjes së ADN-së dhe riparimi i polimorfizmave të gjeneve të thyerjes së dyfishtë dhe niveli i aberracionit të kromozomeve tek fëmijët me ekspozim afatgjatë ndaj radonit // Int. J. Radiat. Biol., 2016, vëll. 92, nr. 8, fq. 466-474.

13. Wojewodzka M., Kruszewski M., Iwanenko T. et al. Mungesa e efektit negativ të zakonit të pirjes së duhanit në thyerjen e vargut të ADN-së dhe dëmtimin e bazës, siç zbulohet nga analiza e kometës alkaline // Mutat. Res., 1999, vëll. 440, fq. 19–25.

14. Geric M., Gajski G., Orescanin V., Garaj-Vrhovac V. Variacionet sezonale si faktorë parashikues të parametrave të analizës së kometës: një studim retrospektiv // Mutagenesis, 2017, doi:10.1093/mutage/gex023.

Ndikimi i radonit është studiuar mirë në intervalin e përqendrimit të lartë. Standardet e vendosura higjienike parashikojnë një nivel të aktivitetit vëllimor ekuilibër ekuivalent (EEVA) prej 200 Bq/m3 si kufi i aktivitetit vëllimor të lejuar të radonit në ajrin e banesave. Në të njëjtën kohë, në një sërë vendesh, niveli i lejuar është rritur në 400 Bq/m3, gjë që shpjegohet, para së gjithash, nga veçoritë gjeologjike të territorit. Nga ana tjetër, ekziston një këndvështrim për nevojën për të ulur nivelin e lejuar në 2 pCu/l, që korrespondon me 74 Bq/m3. Brenda kuadrit të paradigmës moderne të OBSH-së dhe parimit të një rritjeje lineare jo-prag të efekteve të rrezatimit, edhe një ekspozim i vogël rrezatimi çon në një rritje të rrezikut të efekteve stokastike (kryesisht kancerit).

Natyrisht, efektet e vogla të rrezatimit që prekin grupe të mëdha njerëzish mund të çojnë në një rritje të konsiderueshme shoqërore të incidencës së kancerit. Si rezultat, duket jashtëzakonisht e rëndësishme që të grumbullohen informacione mbi efektet e llojeve të ndryshme të rrezatimit jonizues në doza të vogla, ndaj të cilave e gjithë popullsia e planetit është e ekspozuar në një shkallë ose në një tjetër. Një rritje e radonit EEVA mbi 200 Bq/m3 njihet si e padëshirueshme për shumicën e standardeve të pranuara në fushën e higjienës së rrezatimit. Në të njëjtën kohë, vetëm 5-10% e ambienteve të banimit mund t'i atribuohen ambienteve me një nivel të tillë ekspozimi. Niveli i aktivitetit volumetrik (VA) të radonit në 2 pCu/l (74 Bq/m3) e lart mund të vërehet në 20-50% të ambienteve të banimit, në varësi të llojit të zhvillimit dhe vendndodhjes gjeografike. Natyrisht, edhe ekspozimi me intensitet të ulët ndaj radonit mund të çojë në një rritje të konsiderueshme të incidencës, duke pasur parasysh shkallën globale të problemit. Duket e rëndësishme të studiohet efekti i ngarkesave me dozë të ulët të rrezatimit të dendur jonizues në trupin e njeriut.

Radoni njihet aktualisht si një nga kancerogjenët më të rrezikshëm që prek njerëzit. Në natyrë, faktori i radonit të rrezatimit nuk luan një rol të rëndësishëm, pasi gazi i radonit shpërndahet në një vëllim të madh ajri dhe prishet mjaft shpejt (gjysma e jetës Rn222 = 3,82 ditë). Në të njëjtën kohë, ndërtesat e banimit dhe ato teknike janë një lloj kurthe që grumbullojnë radon (deri në 10 herë në krahasim me ajër të hapur). Vatra e radonit shpesh ndodhen në mënyrë sporadike, radoni konsiderohet si shkaktari kryesor i rritjes së shpeshtësisë së aberracioneve kromozomale në grupe të ngjashme të ekspozuara.

Një nga metodat efektive të biomonitorimit është vlerësimi i drejtpërdrejtë i shkallës së dëmtimit të ADN-së në qelizat e gjakut me metodën e "kometës së ADN-së" (elektroforeza me xhel të qelizave individuale). Kjo metodë përfshin lizën e qelizave të vendosura në një xhel agarozë, ndërsa ADN-ja migron në një fushë elektrike. Qelizat me një frekuencë të shtuar të thyerjeve të dyfishta karakterizohen nga shtimi i migrimit të ADN-së në anodë. Në vitin 1988, Singh dhe kolegët propozuan një modifikim alkalik të metodës, duke përfshirë një hap lize në pH>13. Ky version rrit ndjeshëm ndjeshmërinë e metodës, duke lejuar zbulimin e thyerjeve të vetme, vendeve të paqëndrueshme ndaj alkalit, lidhjeve të kryqëzuara të ADN-ADN-së dhe ADN-së, si dhe vendeve të riparimit jo të plotë. Meqenëse efektet e thyerjeve të vetme të ADN-së mbizotërojnë për shumicën e gjenotoksikanëve, modifikimi alkalik i metodës bëri të mundur rritjen e ndjeshme të përmbajtjes së informacionit dhe ndjeshmërisë së testit. Një nga avantazhet kryesore është aftësia për të zbuluar efektet gjenotoksike në kushtet e veprimit të njëkohshëm të faktorëve citotoksikë që çojnë në formimin e çrregullimeve kromozomale, por nuk kanë një efekt gjenotoksik. Në kushte pH>12, ADN-ja denatyrohet dhe fijet zbërthehen për shkak të shkatërrimit të lidhjeve hidrogjenore midis 2 helikave. Me arritjen e një pH prej 12,6 vende alkaline labile, të tilla si vendet apurine/apirimidine, transformohen në thyerje të vetme të ADN-së. Në pH>13 arrihet shkalla maksimale e transformimit të vendeve alkali-labile.

Materiale dhe metoda

Karakteristikë e mostrës

Çdo person i anketuar plotësoi një pyetësor personal që përfshinte informacion në lidhje me moshën, gjendjen shëndetësore, përdorimin e duhanit dhe alkoolit, rreziqet në punë, procedurat e diagnostikimit me rreze X, udhëtimin ajror, vaksinimet dhe marrjen e medikamenteve gjatë 3 muajve para anketës. U zgjodh një grup prej 39 subjektesh që nuk ishin të ekspozuar ndaj faktorëve potencialisht gjenotoksikë. Të gjithë të ekzaminuarit ishin nën 40 vjeç. Janë ekzaminuar gjithsej 18 burra (mosha mesatare 29 vjeç) dhe 21 gra (mosha mesatare 31 vjeç).

Studimi u krye në përputhje me kërkesat e Komisionit për Etikën e Universitetit Shtetëror të Kemerovës, protokolli i studimit u miratua në mbledhjen e Komisionit nr. 4, datë 10 tetor 2016. Secili pjesëmarrës nënshkroi një formular pëlqimi të informuar që përmban informacione për objektivat e studimit.

Mostrat e biomaterialeve

Mostrat e gjakut venoz u mblodhën në tuba vakum 4 ml që përmbajnë natrium-EDTA si një antikoagulant. Materiali është grumbulluar nga nëntori 2016 deri në prill 2017. Brenda 1-2 orësh, mostrat u transportuan në laborator. Të gjitha mostrat u koduan dhe u përpunuan. Metoda e kometës së ADN-së filloi menjëherë pas mbërritjes së mostrave.

Elektroforeza me xhel të qelizave individuale (metoda e kometës së ADN-së)

Metoda e kometës së ADN-së u krye në një modifikim alkalik të zhvilluar nga Singh et al. Shtresa e parë e xhelit ishte një zgjidhje 1% e agarozës standarde (Applichem, SHBA). Qelizat u vendosën me agarozë 1% me pikë shkrirjeje të ulët (Applichem, USA) në 39°C. 70 μl e një suspensioni të qelizave të gjakut në agarozë me shkrirje të ulët u vendosën në një gotë me agarozë standarde dhe u vendos në akull derisa xheli të ngurtësohej plotësisht. Pas ngurtësimit, rrëshqitjet u vendosën në një tampon lize në 4°C për 12 orë. Përbërja e tamponit të lizës: 2,5 mol/l NaCl (Vekton, Rusi), 0,1 mol/l Na2EDTA (Vekton, Rusi), 1% Triton X-100 (Amresco, SHBA), 10% DMSO ("Vekton", Rusi ). Pas lizës u krye elektroforeza horizontale (300 mA, 25 V, 30 min) në bufer alkaline (pH>13). Elektroforeza u parapri nga 20 min. trajtim me një tampon alkalik (300 mM NaOH (Vekton, Rusi), 1 mM Na2EDTA (Vekton, Rusi). Liza dhe elektroforeza u kryen në 4°C në mungesë të dritës së drejtpërdrejtë të diellit. Pas elektroforezës, gotat u neutralizuan tre herë në solucion të kripur të puferuar me fosfat PBS pH 7,5 (Amresco, SHBA) Pas kësaj, rrëshqitjet u trajtuan me 70% etanol për 5 minuta, u thanë dhe u ngjyrosën me 50 μl të një SYBR GREEN të vetme (Biotech-Industriya, Rusi).

Analiza e "kometave"

Parametrat e fragmentimit u vlerësuan me mikrofotografi të preparateve të ngjyrosura me SYBR GREEN duke përdorur mikroskopin Zeiss Axio Imager 2. Gjithsej 100 kometa të zgjedhura rastësisht u fotografuan nga çdo mostër e studiuar me zmadhim x400. Përpunimi i mëpasshëm i fotografive u krye duke përdorur paketën softuerike CASP. Janë llogaritur parametrat e gjatësisë së bishtit të kometës, momentit të bishtit dhe fraksionit të ADN-së në bishtin e kometës.

Metodat Statistikore

Analiza e të dhënave statistikore është kryer duke përdorur paketën Statistica 10.0. Për rezultatet, janë llogaritur vlerat mesatare dhe kufijtë e intervalit të besimit 95% (CI 95). Krahasimet në grup u bënë duke përdorur testin U Mann-Whitney. Shkalla e rëndësisë u mor në nivelin 5%. Korrelacioni ndërmjet masave për rastin e të dhënave joparametrike është llogaritur duke përdorur koeficientin e korrelacionit të Pearson-it për rangjet. Në të njëjtën kohë, për mostrat prej më shumë se 50 personash, është llogaritur edhe vlera e testit të Studentit, bazuar në vlerën e koeficientit të korrelacionit Pearson.

rezultatet

Përqindja e ADN-së në bishtin e kometës nuk i kalonte 15%. Vlera mesatare e aktivitetit vëllimor (VA) të radonit në ajrin e brendshëm ishte 89,4 Bq/m3, vlera AEDR e sfondit gama ishte 0,12 μSv/h, dendësia e fluksit të rrezatimit beta ishte 0,6 s-1. Niveli i fragmentimit të ADN-së në 3 parametra u rrit tek meshkujt, por ky trend nuk arriti domethënie statistikore (Tabela 1).

Tabela 1

Treguesit e fragmentimit të ADN-së tek burrat dhe gratë e ekzaminuara

Niveli prej 74 Bq/m3, që korrespondon me 2 pCu/l ajër, u zgjodh si niveli kufitar i radonit RA në ajër. VA mesatare e radonit ishte 47 Bq/m3 në grupin e parë dhe 143 Bq/m3 në grupin e dytë. Përmbajtja më e madhe e informacionit u krijua për treguesin e momentit të bishtit të kometave. Momenti i bishtit ishte i ngritur në grupin më të lartë të radonit, por kjo tendencë nuk arriti nivelin e rëndësisë statistikore (Tabela 2). Ky trend është tipik vetëm për meshkujt e anketuar.

tabela 2

Treguesit e fragmentimit të ADN-së në grupe të diferencuara sipas gjinisë dhe radonit OA

U studiua gjithashtu një varësi e mundshme e treguesve të ADN-së nga madhësia e ADER të rrezatimit gama në ambientet e banimit. Për verifikim, u llogarit koeficienti i korrelacionit midis indekseve të dëmtimit të ADN-së dhe ADER-it të rrezatimit gama. U gjet një korrelacion pozitiv midis parametrave të kometave të ADN-së dhe një rritje të fuqisë së rrezatimit gama (figura). Në të njëjtën kohë, ADER i rrezatimit gama ishte brenda kufijve të lejuar në të gjitha ambientet e ekzaminuara.

Varësia e treguesve të fragmentimit të ADN-së nga AEDR e rrezatimit gama në ambientet e banimit (r - koeficienti i korrelacionit Spearman, p - probabiliteti i hipotezës "nul")

Diskutim

Ekspozimi ndaj rrezatimit

Rrezatimi jonizues është i aftë të nxisë formimin e grupimeve të dëmtimit të ADN-së, i cili realizohet në formën e thyerjeve të dyfishta dhe dëmtimeve të tjera të vendosura në mënyrë kompakte. Rrallëherë dhe rrezatimi jonizues i dendur shkakton afërsisht të njëjtin numër lezionesh individuale të ADN-së për njësi të dozës së absorbuar, por në rastin e rrezatimit jonizues të dendur (grimcat alfa), këto lezione shpërndahen në një numër më të vogël rajonesh të ADN-së, gjë që nënkupton një rritje të numri i lezioneve në grup; për shembull, numri mesatar i dëmtimeve në një grup ka tendencë të rritet me transferimin linear të energjisë. Rrezatimi gama, i regjistruar në vendet e banimit të të gjithë të ekzaminuarve, nuk i kalon vlerat e rregulluara të sfondit. Ndryshimet në sfondin gama, ka shumë të ngjarë, u shkaktuan nga tiparet e ndërtesave dhe materialeve të ndërtimit.

Analiza e "kometave"

Metoda e kometës së ADN-së është një test i thjeshtë dhe i shpejtë që mat në mënyrë efektive nivelin e dëmtimit të ADN-së dhe riparimin e dëmtimit pas ekspozimit. Në këtë studim nuk u konstatua asnjë heterogjenitet domethënës përsa i përket nivelit të dëmtimit të ADN-së në popullatën e studiuar. Në një numër punimesh kushtuar dozimetrisë biologjike, vështirësitë e zbulimit të efektit të dozave të ulëta të rrezatimit u vunë re më herët. Në të njëjtën kohë, shumica e studimeve studiuan grupe personash të ekspozuar ndaj një burimi artificial të jashtëm, për shembull, personeli i instalimeve radiologjike dhe radiologjike.

Matjet e shkallës së fragmentimit të ADN-së mund të pasqyrojnë si nivelin individual të dëmtimit të ADN-së ashtu edhe aftësinë për të riparuar dëmtimin nga rrezatimi. Më parë, një numër studimesh përcaktuan aftësinë e gjeneve riparuese për të moduluar shpeshtësinë e çrregullimeve materiale trashëgimore. Modeli i vëzhguar i dëmtimit të ADN-së është rezultat i një ekuilibri midis dëmtimit dhe riparimit të ADN-së, dhe nivelet e ulëta të dëmtimit ose mungesa e korrelacioneve të forta mund të jetë rezultat i dëmtimit të ulët dhe efikasitetit të lartë të riparimit individual.

Sipas disa vlerësimeve, stina e vitit (parametrat rriten në verë) dhe ekspozimi mjekësor japin kontributin më të madh në rritjen e treguesve të ADN-së së kometës për faktorët joprodhues. Në punën tonë këta faktorë nuk mund të kenë një ndikim të rëndësishëm, pasi grumbullimi i materialit biologjik bëhej në periudhën dimërore të vitit dhe të gjithë personat që iu nënshtruan ekzaminimeve me rreze X gjatë 3 muajve para studimit u përjashtuan nga kampioni. . Mungesa e korrelacioneve me përqendrimin vëllimor të radonit mund të jetë për shkak të madhësisë së vogël të mostrës. Në të ardhmen, është planifikuar të vazhdojë kjo linjë e hulumtimit me një rritje të madhësisë së kampionit.

konkluzioni

Studimi i efekteve të ekspozimit afatgjatë ndaj dozave të ulëta të rrezatimit është një detyrë e vështirë; nevoja për të zgjedhur mostra dhe për të kontrolluar faktorët shoqërues mund të shtrembërojë pamjen. Në studimin e paraqitur, nuk ishte e mundur të identifikoheshin korrelacione statistikisht domethënëse me treguesit e aktivitetit vëllimor të radonit, por në të njëjtën kohë, korrelacionet e gjetura me treguesit e sfondit gama tregojnë perspektivat e këtij studimi. Është e qartë se është e nevojshme të vlerësohet faktori i efikasitetit të riparimit të atyre të ekzaminuar për një studim të këtij lloji; kjo do të lejonte diferencimin dhe krahasimin e njerëzve me karakteristika të ngjashme riparimi.

Nuk ka konflikt interesi në lidhje me këtë studim.

Studimi u mbështet nga Fondacioni Rus për Kërkime Bazë (nr. 16-34-60069\15 mol_a_dk).

Lidhje bibliografike